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綜述|循環(huán)腫瘤細胞：從生物學新見解到臨床實踐

Circulating tumor cells: from new biological insights to clinical practice

癌癥患者高死亡率的主要原因是轉(zhuǎn)移，即腫瘤細胞通過血流從原始部位遷移到身體的其他部位。最近的技術(shù)進步顯著增強了我們對循環(huán)腫瘤細胞 （CTC） 血源性擴散機制的理解。DNA 甲基化是一個關(guān)鍵過程，調(diào)節(jié)基因表達和染色體穩(wěn)定性，從而維持體內(nèi)的動態(tài)平衡。整體低甲基化和基因座特異性高甲基化是 DNA 甲基化模式變化的例子，這些變化對致癌至關(guān)重要。

綜述首先概述了導致 CTC 形成的各種過程，包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （EMT）、免疫監(jiān)測和定植。然后深入分析了 CTC 中 DNA 甲基化的修飾如何影響 CTC 傳播過程中的每個關(guān)鍵階段。此外探討了 CTC 中 DNA 甲基化變化對癌癥患者的潛在臨床意義。通過了解這些表觀遺傳修飾，我們可以深入了解轉(zhuǎn)移過程，并確定用于早期檢測、預后和靶向治療的新生物標志物。本綜述旨在彌合基礎研究和臨床應用之間的差距，強調(diào) DNA 甲基化在癌癥轉(zhuǎn)移背景下的重要性，并為改善患者預后提供新途徑。

循環(huán)腫瘤細胞 （CTC） 是液體活檢的基本組成部分。CTC 的概念最初由 Ashworth 于 1969 年提出，可分為三類：上皮型、間充質(zhì)型和混合表型細胞。雖然大多數(shù) CTC 可以被宿主免疫系統(tǒng)消除，但一部分高度活躍和轉(zhuǎn)移性的 CTC 可能會逃避免疫清除，最終導致微觀癌癥病灶的建立、腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，CTC 被認為是個體致命轉(zhuǎn)移性疾病的合理來源。

CTC轉(zhuǎn)移的途徑、位置

a. 腫瘤細胞從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤中自然脫落，并在血液中循環(huán)。

b. 作為腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”，可能導致形成其他各種部位的轉(zhuǎn)移病灶。

為了成功從原發(fā)性腫瘤組織中分離，CTC 必須克服幾個障礙，包括：

1） 粘附：原發(fā)性腫瘤組織中的細胞外基質(zhì) （ECM） 和周圍細胞都被癌細胞牢牢粘附，癌細胞通常具有高度粘性。CTC 必須克服這些粘附力才能分離并進入淋巴或血液系統(tǒng)。

2） 侵襲：癌細胞還必須能夠侵入鄰近組織才能到達淋巴管或血管。這需要細胞降解 ECM 和周圍組織。

3） 剪切應力：一旦進入血液或淋巴系統(tǒng)，CTC 就會由于液體的運動而受到顯著的剪切應力。這會對細胞造成機械損傷，還會引發(fā)細胞凋亡（細胞死亡）。

4） 免疫系統(tǒng)監(jiān)測：免疫系統(tǒng)不斷監(jiān)測血液和淋巴系統(tǒng)是否有外來或異常細胞。CTC 必須避免被免疫系統(tǒng)檢測到才能生存并可能形成繼發(fā)性腫瘤。

總體而言，CTC 分離和傳播的過程很復雜，涉及許多不同的因素。

分化的祖細胞或體細胞干細胞可能是具有腫瘤起始能力的癌癥干細胞 （CSC） 的來源。CSC亞群可能是導致復發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因，CTC 研究的主要目標是識別和消除這種循環(huán) CSC 群體。在識別和分離 CTC 中的 CSC 后，有可能更有效地對抗殘留癌癥。循環(huán) CSC 的起源可以考慮用兩種假設來闡明。一是癌性體細胞干細胞經(jīng) EMT 從主要腫瘤中排出進入循環(huán)，這些細胞被稱為間充質(zhì) CSC。二是這些細胞可能是完全分化的癌細胞的結(jié)果，這些癌細胞經(jīng)歷了 EMT 途徑以獲得遷移特性。無論途徑如何，最終結(jié)果是 CSC 的擴散，CSC 通過表現(xiàn)出間充質(zhì)、上皮和干性特征組合的中間細胞向生態(tài)位方向移動。這可以解釋在 CTC 內(nèi)的腫瘤起始細胞中觀察到的表面標志物和/或轉(zhuǎn)錄因子的多樣性。CTC 的異質(zhì)性，源自 CSC 中的 EMT 或分化的癌細胞，強調(diào)了選擇識別重要標志物的挑戰(zhàn)。

支持 CTC存活和早期轉(zhuǎn)移的 EMT 相關(guān)機制

a. CTC通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)機制釋放到血液中，包括單個細胞或集體遷移、內(nèi)滲以及被動過程，例如分離的腫瘤細胞或團塊通過受損血管的分離。某些單個或成簇的 CTC能夠在血液中存活并在次級器官中形成轉(zhuǎn)移。這是由于它們具有在 EMT誘導的細胞中升高的特性，并有助于它們在血液中的存活和轉(zhuǎn)移的建立。

b. Fas/FasL信號通路在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，其中癌細胞損傷會導致對細胞凋亡的抵抗并導致腫瘤進展和 CTC的產(chǎn)生，cEMT 進展受整合素和 TGF-B等信號通路的調(diào)節(jié)，這些通路可以協(xié)同誘導下游反應，促進 CTC存活和抗細胞凋亡特性。

CTC 簇生成的機制和潛在的 CTC 亞群在血液循環(huán)中存活

發(fā)生 EMT 的 CTC 會表達組織因子（TF），顯著促進血小板活化。這些凝血依賴性機制啟動了腫瘤細胞周圍富含纖維蛋白/血小板的繭的形成，據(jù)信可以保護細胞免受剪切應力、失巢凋亡和免疫攻擊。上述繭的形成對于 CTC 播種和早期建立至關(guān)重要。此外，已觀察到中性粒細胞與腫瘤細胞和血小板發(fā)生物理相互作用，從而促進腫瘤細胞存活和增殖。此外，中性粒細胞有助于 CTC 粘附到血管壁上。中性粒細胞通過它們在中性粒細胞胞外陷阱 （NET） 中捕獲腫瘤細胞的能力——這些結(jié)構(gòu)也促進凝血事件——有助于形成支持 CTC 存活的保護和錨定支架。這個過程有助于 CTC 在毛細血管中停滯和轉(zhuǎn)移形成的早期階段。上述凝血和中性粒細胞依賴性屏蔽機制可保護 CTC 免受免疫破壞。此外，CTC，尤其是那些接受 EMT 的 CTC，具有更強的逃避免疫監(jiān)視的能力。促成這種情況的一種機制是免疫檢查點蛋白（如 PD-L1）的表達，這可能會增強它們對細胞毒性免疫細胞的抵抗力。在可能的休眠期后，CTC 最終可以恢復生長并引發(fā)繼發(fā)性腫瘤。

CTC與免疫系統(tǒng)監(jiān)測

CTC 克服免疫系統(tǒng)監(jiān)視的機制尚不完全清楚，但有幾種可能的方式可以逃避免疫系統(tǒng)的檢測。一種解釋是 CTC 抑制或掩蓋免疫細胞通常識別為異常或外來的表面抗原的表達。這會使 CTC對免疫系統(tǒng)的可見度降低，并使它們能夠逃避檢測。另一種可能性是 CTC 產(chǎn)生抑制或抑制免疫反應的因子，例如將免疫細胞募集到腫瘤微環(huán)境中但隨后抑制其功能的細胞因子或趨化因子。例如，研究表明，CTC 可以產(chǎn)生細胞因子 TGF-β，它可以抑制 T 細胞和其他免疫細胞的活性。最后，CTC 可能能夠通過模擬正常細胞或使用其他機制來避免被發(fā)現(xiàn)來逃避免疫監(jiān)視。例如，一些 CTC 可能表達通常存在于健康細胞中的蛋白質(zhì)或分子，導致免疫系統(tǒng)難以將它們與健康細胞區(qū)分開來。

外周血中 CTC 的免疫逃逸機制

該圖描述了 CTC 用于規(guī)避免疫系統(tǒng)的各種機制以及 CTC 與外周血中免疫細胞之間發(fā)生的相互作用。循環(huán)腫瘤細胞 （CTC） 和自然殺傷 （NK） 細胞之間的相互作用是一個突出的研究領域，因為 CTC 分泌 LDH5 并通過 ADAM10 脫落 MICA/MICB 配體，從而抑制通過 NK 細胞介導的裂解識別和消除 CTC。該圖描繪了 CTC 采用的三種機制，以逃避 NK 細胞和 T 細胞通過 MHC I 分子的識別。這些策略包括通過與細胞表面結(jié)合的細胞角蛋白（CK8、CD18 和 CK19）掩蓋 TCR 對 MHC I 的識別，通過膜從血小板轉(zhuǎn)移到 CTC 獲得“偽正常”表型，以及減少或完全消除 MHC I 表達。CTC 與自然殺傷 （NK） 細胞之間的相互作用是一個重點領域，因為 ADAM10 從 CTC 中釋放 LDH5 和 MICA/MICB 配體會阻止它們通過 NK 細胞介導的裂解進行識別和消除。此外，LDH5 增強循環(huán)單核細胞上的 NKG2D 配體表達，進而降低 NK 細胞上的 NKG2D 表達。此外，該圖說明了 CTC 用于逃避免疫系統(tǒng)的其他策略，例如抑制性免疫檢查點分子 PD-L1 的上調(diào)、“別吃我”信號受體 CD47 的表達，以及凋亡蛋白 FAS 和/或 FASL 的表達改變。

表觀遺傳修飾在破譯 CTC 特性中的作用

表觀遺傳學涉及對基因表達的可遺傳改變的研究，這些改變發(fā)生在不對 DNA 序列本身進行修飾的情況下。許多表觀遺傳修飾，包括組蛋白乙酰化和甲基化模式、microRNA 介導的基因調(diào)控、癌基因的低甲基化、腫瘤抑制基因的高甲基化等，極大地促進了癌癥的進展。

DNA 甲基化是甲基添加到 DNA 的胞嘧啶殘基上，對于調(diào)節(jié)基因表達至關(guān)重要。偏離正常或預期模式的 DNA 甲基化模式與各種健康狀況有關(guān)，包括癌癥。幾項研究表明，與原發(fā)性腫瘤相比，CTC 具有不同的 DNA 甲基化譜，這可能有助于檢測早期癌癥、預測癌癥預后和開發(fā)靶向治療。CTC 表現(xiàn)出與原發(fā)性腫瘤不同的獨特 DNA 甲基化模式。此外，CTC 的 DNA 甲基化模式也會受到治療的影響。 CTC 的基因甲基化景觀以及這些甲基化變化如何導致 CTC 介導的轉(zhuǎn)移還需要進一步的研究來揭示。此類研究可以揭示與轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤特異性表觀遺傳特征和腫瘤種群的異質(zhì)性。

跨癌癥類型 CTC 中不同基因的異常甲基化

在 CTC 中起作用的不同 DNA 甲基化修飾以促進轉(zhuǎn)移

甲基化促進 CTC 分離和侵襲的過程是復雜的，涉及各種基因的高甲基化和低甲基化。上圖描述了不同類型甲基化改變對CTC轉(zhuǎn)移潛力的影響

a. 腫瘤抑制基因 （TSG） 和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 （MSG） 的高甲基化觸發(fā)了 CTC 的分離，并有助于增強其增殖能力。與單個 CTC 相比，CTC 簇表現(xiàn)出不同的 DNA 甲基化譜，其特點是 OCT4、NANOG、SOX2 和 SIN3A。

b. 等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點低甲基化，這些轉(zhuǎn)錄因子是與干性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在誘導多能干細胞 （iPSC） 的多能性網(wǎng)絡中起著至關(guān)重要的作用。

CTC 相關(guān)免疫中的 DNA 甲基化調(diào)節(jié)

DNA 甲基化在適應性免疫應答中起關(guān)鍵作用，包括樹突狀細胞發(fā)育和 T 細胞啟動和激活。

a 最近的研究揭示了染色質(zhì)重塑對腫瘤細胞中細胞毒性攻擊的反應和腫瘤浸潤 CD8 T 細胞中耗竭表型的貢獻。

b CTLA-4 DNA 高甲基化與治療反應不佳顯著相關(guān)，突出了 CTLA-4 甲基化作為治療結(jié)果預測生物標志物的潛力。

c 在腫瘤細胞中，DNA 修飾會影響腫瘤抗原的產(chǎn)生、抗腫瘤細胞因子的沉默和 PD-L1 檢查點的誘導。

d 在 NK 細胞中，殺傷性 Ig 樣受體 （KIR） CpG 島的甲基化狀態(tài)對于維持克隆性 KIR 表達和調(diào)節(jié) NK 細胞識別和異常細胞裂解至關(guān)重要。

CTC甲基化模式的診斷及預后價值

對 CTC 中 DNA 甲基化模式的研究跨越多種癌癥類型，為它們作為診斷、預后和治療靶向的生物標志物的潛力提供了見解。Madhavan 等人在研究 CTCDNA 作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌預后診斷的潛力時，強調(diào)了循環(huán)游離 DNA 中甲基化模式作為腫瘤進展和治療反應標志物的重要性。Powrózek 等人檢查了 NSCLC 患者 CTC 中的 SHOX2 基因甲基化，發(fā)現(xiàn) SHOX2 甲基化可以作為 NSCLC 預后和診斷的無創(chuàng)生物標志物。這表明 CTC 中的甲基化分析可能用于臨床目的。已在癌癥患者的 CTC 中檢測到異常的 DNA 甲基化譜，這些模式已顯示出作為診斷或預后生物標志物的前景。例如，Wong 等人的研究檢查了肺癌患者 CTC 的 DNA 甲基化模式，發(fā)現(xiàn)患者生存率與特定基因的甲基化水平之間存在相關(guān)性，HOXA9 和 LMX1A 基因的高甲基化水平與較差的總生存期相關(guān)，而 IGFBP3 基因的高甲基化水平與較好的總生存期相關(guān)。Wu 等人的另一項研究調(diào)查了肺腺癌患者 CTC 的 DNA 甲基化模式，并確定了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異甲基化基因，GABRB2、CLDN3 和 SFRP1 的甲基化水平在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移患者的 CTC 之間存在顯著差異。

CTC 的 DNA 甲基化在肺癌中的應用

CTC 臨床應用研究進展

目前根除轉(zhuǎn)移的方法與用于原發(fā)性腫瘤的方法相同：專注于增殖和腫瘤發(fā)生，而不是直接解決轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應。如果已經(jīng)發(fā)生播散，則原發(fā)性腫瘤的手術(shù)干預或全身治療并不總是能根除轉(zhuǎn)移源。大多數(shù)抗癌藥物在轉(zhuǎn)移情況下進行初步評估，然后重新用于輔助治療以阻止轉(zhuǎn)移擴散。專門針對轉(zhuǎn)移的藥物的稀缺性，是許多臨床前研究和對未來臨床試驗框架正面臨的挑戰(zhàn)。從理論上講，針對轉(zhuǎn)移過程中不同點的 CTC 的療法可以阻止轉(zhuǎn)移性癌癥的進展，因為 CTC 是轉(zhuǎn)移性癌癥的原因，并且可能來自腫瘤內(nèi)的不同亞群。

CTC 存在于所有主要癌癥類型的外周血中，其對結(jié)直腸、乳腺癌、前列腺以及小細胞和非小細胞肺惡性腫瘤預后的意義已得到驗證。當患者首次被診斷出患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌時，開始治療前較高的 CTC 計數(shù)是較短的無病生存期和總生存期的預測指標。對于結(jié)直腸癌和前列腺癌患者，治療前 CTC 計數(shù)與臨床預后之間也有研究報道其負相關(guān)關(guān)系。許多研究表明，與基線 CTC 水平相比，治療后 CTC 計數(shù)的波動提供了更可靠的預后見解。治療后 CTC 的持續(xù)存在與較差的預測相關(guān)。在接受治療的患者中，除了單次 CTC 計數(shù)外，CTC 簇豐度的評估還顯著提高了預后價值。

CTC 計數(shù)可在疾病臨床表現(xiàn)前 7-9 周檢測到。這表明患者的 CTC 分析可有助于預測微小殘留病和后期復發(fā)的可能性，并可作為早期癌癥診斷的工具。由于無創(chuàng)、高度可重復性和敏感性，循環(huán)腫瘤 DNA 甲基化的檢測已成為治療后動態(tài)監(jiān)測腫瘤反應的關(guān)鍵方法。通過動態(tài)監(jiān)測循環(huán)腫瘤 DNA 甲基化，可以進行早期腫瘤復發(fā)檢測，這有助于臨床決策。

靶向CTC 甲基化腫瘤治療研究進展

循環(huán)腫瘤 DNA 提供的腫瘤信息有助于指導后續(xù)的靶向治療選擇。目前的研究主要集中在循環(huán)腫瘤 DNA 中的突變信息，詳細的基因突變分析可以闡明癌癥分子圖譜，從而有可能帶來更合適的治療方案。而關(guān)于使用循環(huán)腫瘤 DNA 甲基化進行治療靶點選擇的研究很少。這種差異是由于癌癥患者循環(huán)腫瘤 DNA甲基化狀態(tài)變化是腫瘤反應而不是腫瘤原因。

令人振奮的是，使用 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑時，胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌在內(nèi)的癌癥可能會受益于 DNA 甲基化靶向治療。有研究展示了CTC 中的 DNA 甲基化模式具有治療意義。例如，Chen 等人的一項研究表明，用一種叫做地西他濱的 DNA 去甲基化劑治療，通過逆轉(zhuǎn)肺癌患者細胞中異常的 DNA 甲基化模式，減少了這些細胞的 CTC 轉(zhuǎn)移。CTC 的 DNA 甲基化譜已顯示出在肺癌診斷、預后和治療方面的巨大潛力。

總結(jié)

CTC 是從原發(fā)腫瘤分離并進入淋巴或循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞。這使得腫瘤細胞能夠擴散到全身并導致新腫瘤的形成。患者血液中的 CTC 數(shù)量與疾病的進展和轉(zhuǎn)移的機會相關(guān)，甚至在通過常規(guī)方法識別腫瘤之前，患者的血液中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 CTC，這提供了證據(jù)表明它們可能是腫瘤早期識別和監(jiān)測的寶貴工具。

DNA 甲基化是甲基添加到 DNA 的胞嘧啶殘基上，是調(diào)節(jié)某些基因表達所必需的。許多癌癥類型，包括肺癌，都與疾病發(fā)作和進展時的異常 DNA 甲基化模式有關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) DNA 甲基化在CTC 的免疫監(jiān)視和轉(zhuǎn)移中都起作用。免疫系統(tǒng)識別和清除癌細胞的方法稱為免疫監(jiān)視。然而，通過 DNA 甲基化，CTC 可以抑制免疫相關(guān)基因的表達，使它們能夠逃避免疫系統(tǒng)并持續(xù)存在于血液中。例如，已發(fā)現(xiàn)一些 CTC 具有參與抗原加工和呈遞的基因的 DNA 高甲基化，這可能有助于它們逃避免疫系統(tǒng)的識別和消除。此外，DNA 甲基化也參與 CTC 的轉(zhuǎn)移。例如，EMT 過程對癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，它與參與細胞粘附和遷移的基因 Ecadherin的 DNA高甲基化有關(guān)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) CTC 的轉(zhuǎn)移潛力受 DNA 修復和細胞周期調(diào)控相關(guān)基因低甲基化的影響。

這篇綜述概括了在癌癥背景下圍繞 CTC 生成的障礙，以及表觀遺傳學修飾對 CTC 在 EMT、免疫監(jiān)視、集群形成和定植方面的影響。CTC 中 DNA 甲基化導致的表觀遺傳修飾可能是解開肺癌轉(zhuǎn)移潛在機制的關(guān)鍵，并在肺癌診斷、預后和治療領域具有重要前景。